Sviluppo di RT multiplex quantitativa

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12073 (2023) Citare questo articolo

299 accessi

2 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

L’epatite Delta è una malattia causata dall’esposizione ai virus dell’epatite B (HBV) e dell’epatite D (HDV), solitamente con un esito clinico più grave rispetto a una monoinfezione da HBV. Ad oggi, la reale prevalenza dell’infezione da HDV è sottostimata e i metodi di rilevamento sono scarsamente disponibili, soprattutto nelle regioni più endemiche. Pertanto, è stato sviluppato un metodo RT-qPCR in un unico passaggio per la quantificazione dell'HDV-RNA. I campioni biologici sono stati selezionati tra il 2017 e il 2023 da pazienti dell'Ambulatório Especializado em Hepatites Virais del Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia e Serviço de Assistência Especializada e sono stati sottoposti al test sviluppato da questo studio e a un secondo test quantitativo RT-qPCR. La pendenza del test quantitativo iniziale era − 3,321 con un'efficienza del 100,04% e un fattore di amplificazione pari a 2. L'analisi dei dati di ripetibilità ha rivelato un limite di quantificazione di 5 copie/reazione e un limite di rilevamento (95%) di 2,83 copie per reazione. Nei test di sensibilità diagnostica è stata riscontrata un'accuratezza del 97,37% rispetto al test di riferimento. Questo test si è rivelato altamente efficiente e riproducibile, rendendolo uno strumento prezioso per monitorare i pazienti con epatite Delta e valutare il rischio di progressione della malattia, nonché l’efficacia del trattamento.

Il virus dell'epatite delta (HDV) classificato nel genere Deltavirus è atipico, presenta circa 1.700 nucleotidi di un singolo filamento di RNA di polarità negativa di dimensione compresa tra 36 e 43 nm e nella sua struttura esterna presenta proteine ​​di superficie del virus dell'epatite B (HBV )1,2. L'infezione da HDV è preceduta da una precedente esposizione, da un'infezione in corso o da una simultanea infezione da HBV. Di solito il suo esito clinico sarà più grave, caratterizzato da una progressione accelerata verso la cirrosi o il carcinoma epatocellulare rispetto alla monoinfezione da HBV3,4,5.

Attualmente è difficile stimare con precisione la prevalenza dell’HDV a livello mondiale; almeno 12-15 milioni di persone potrebbero essere infettate dal virus, distribuite in Africa, Asia, Americhe, Mediterraneo orientale ed Europa6,7. In Sud America, l’area endemica dell’HDV si trova nel nord (regione del bacino amazzonico) e copre diversi paesi5,8,9,10. In Brasile, tra il 2000 e il 2021, il numero di casi segnalati è stato di 4.259. Questi numeri possono essere considerati sottostimati poiché questa malattia rimane trascurata in tutto il paese e non esiste una ricerca attiva di pazienti monoinfetti da HBV per determinare le coinfezioni11.

La diagnosi sierologica dell'infezione da HDV si basa sulla rilevazione degli anticorpi anti-HDV totali nel siero. La presenza di HDAg nel tessuto epatico è anche un indicatore clinico che consente la conferma dell'infezione attraverso l'elastografia epatica, una metodica non invasiva e indolore che consente di valutare il grado di fibrosi epatica4,12. Una volta rilevati gli anticorpi anti-HDV, viene utilizzata la diagnostica molecolare per confermare o escludere un’infezione attiva. Il test molecolare viene effettuato ricercando l'RNA dell'HDV nel plasma, quantificato con il metodo RT-qPCR; tuttavia, questo non è convenzionale poiché non esistono kit registrati presso l’Agenzia brasiliana di sorveglianza sanitaria (Anvisa). Anche l’uso di metodi molecolari per quantificare l’HDV in aree ristrette dove professionisti specializzati possono sviluppare test interni rappresenta un fattore limitante13.

Pertanto, la diagnosi molecolare dell’HDV rimane una sfida perché non è ampiamente disponibile per le aree endemiche della regione amazzonica. Lo scopo dello studio era quello di sviluppare un test RT-qPCR quantitativo multiplex one step ad alta sensibilità per la diagnosi e il follow-up dei pazienti affetti da epatite delta.

Il plasmide è stato testato ad intervalli di 1 × 105 e 1,25 copie per reazione (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 e 1,25), per determinare l'efficienza e la linearità dell'amplificazione. Tutti i punti sulla curva di quantificazione superiori a 5 copie per reazione hanno avuto un'amplificazione del 100% in diversi test. La pendenza del test quantitativo iniziale era - 3,321 con un'efficienza del 100,04%, coefficiente di correlazione della linea retta (R2) pari a 0,99 e fattore di amplificazione pari a 2 (vedere Fig. 1).